核心實驗室二 體學研究核心實驗室

體學核心實驗室主要為協助於系統生物學研究中,高通量代謝物與蛋白質資訊的獲得,並發展關鍵技術與建立操作平臺。目前體學核心實驗室主要以代謝體核心實驗室與結構生物學平臺運作,提供各種研發合作與協助。

一、代謝體核心實驗室

本核心實驗室藉由研究氧化壓力調節途徑、植物分化及基因轉殖植物代謝途徑、斑馬魚神經發生調控以及高妊娠血症代謝物生物標誌篩選進行核心實驗室謝體學方法的發展,目前以建立氨基酸、能量代謝、植物賀爾蒙與神經傳導物質的分析項目為發展重點,建立各類代謝物標準質譜分析方法以滿足使用者的需求。透過質譜分析目前已可偵測部分的氧化還原物質,因此可監測生物樣本中氧化還原的狀態,提供如病毒感染時或者細胞分化時氧化壓力的狀態,同時配合觀察其他代謝途徑系統性地瞭解氧化壓力調節的方式。植物分化與基因轉殖植物樣本依需求不同大致分為以氨基酸、能量代謝與植物賀爾蒙監測為主,同時也採用組間代謝物差異篩選尋找預期外的目標代謝物。斑馬魚神經發生調控,分析經雷射處理或基因突變的斑馬魚胚胎代謝物,監測多類神經傳導物質於胚胎發生過程中分佈的狀況。高妊娠血壓症代謝物生物標誌篩選,以達到全血漿代謝體偵測為目的,輔以組間代謝物差異篩選找出有效的生物標誌,以期獲得早期診斷的依據。

現有代謝物分析方法,包括有代謝物標準萃取與代謝物衍生物化學、LC-ESI-QTOF 分析,另有衍生化代謝物氣相層析質譜儀GCMS 分析。整個流程中要建立的方法學有:材料萃取、衍生物化學、液相層析、數據分析等。LC 分析主要以Reverse phase liquid chromatogram (RPLC) 方式進行分析,另外搭配有Hydrophilic interaction liquid chromatogram (HILIC)液相層析方法可供選擇,未來將建再立Ion exchange (IE)於層析的分析。

目前核心實驗室已經有一定的能力可以分析這幾類代謝物,惟代謝物種類繁複,特性歧異缺乏單一標準方法可分析各樣本的全代謝體,未來將著重樣本前處理的方法學開發,主要強調樣本部分純化與衍生物化學為主,合併各種液相層析的結果補足代謝體的分析,並推出各代謝體完整分析的標準程序。

針對帶Carbonyl、carboxyl與phosphate group的代謝物與苯胺(Aniline)進行偶合反應,先以1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC)活化代謝物之官能基後使進行反應,此類代謝物衍生後可增加在RPLC分析的解析與在質譜ESI源游離的效果,經衍生化反應之後的樣本可以獲得較佳的訊號以增加訊號及在定性與定量上的準確性。目前於偵測TCA cycle、pentose phosphate pathway與glycolysis途徑中相關的代謝物,在細胞粗萃取的樣本中可偵測到六至七成的相關代謝物訊號(常規之分析方法僅約兩成)。可應用於逆境生物學的探討,如病毒感染、細胞分化、癌化或遭受氧化壓力時能量代謝途徑的改變。

二、結構生物學平臺

本核心實驗室主要提供結構生物學設施及各項研究合作服務,以及重組蛋白生產材料與技術開發。此外,我們也進行結構生物資訊分析與分子對接等相關分析,幫助使用者利用預測方法獲得分子結構資訊。於重組蛋白生產部分,本核心除提供各項相關工具,並協助使用者對於研究所需蛋白,進行大量表現純化,以利體學與系統生物學實驗之進行。而利用圓二色光譜儀與螢光光譜儀等工具並配合活性測試來鑑定其正確折疊與否,以利後續之研究。同時利用定點突變生產之蛋白來探討蛋白質功能,亦可以快速利用此兩種光學儀器判斷突變影響構型與否。而利用已建立的蛋白結晶篩選儀可快速進行晶體條件篩選,大量節省人力與結晶測試試劑。同時,X光繞射儀的設置與維護,提供用戶作為晶體繞射測試與資料收集。

本核心實驗室亦利用數種儀器分析方式,協助偵測分子交互作用與其結合常數等參數獲得。目前已購置表面電漿共振儀(SPR),以偵測兩分子交互作用。可利用數種方式將蛋白質或其它分子連結於晶片上,經由流入之交互作用分子結合而影響共振特性,於濃度與影響程度的相關性中可計算其結合常數。此外,若是有大量待測物欲待鑑定,亦可利用表面電漿共振儀快速偵測與反應的特性,進行高通量篩選。而圓二色光譜儀可快速提供結構訊息,亦利用小分子與蛋白質混合物之偵測,進行快速藥物之篩選。螢光光譜儀可藉由蛋白質內生性之螢光基團(Trptophan),若交互作用分子靠近而影響其微環境,引發螢光淬熄,亦可用於進行分子交互作用研究。同時若兩分子個別連結螢光donor 和acceptor,可進行螢光能量共振轉移實驗(FRET),鑑定或瞭解兩分子交互作用之關係。而今年也加入恆溫滴定量熱儀(ITC)的儀器分析與方法,可於不需標定待測物的情況下,利用滴定方式偵測結合之吸放熱變化,進而可獲得熱焓、結合常數、結合比例等參數。由於結構生物學平臺所需儀器設施相當多元,因此本計劃主要於X光繞射儀的基本維護與重組蛋白生產之人事外,也利用虛擬平臺與資源共享的觀念,整合各項儀器設施與積極提供合作與服務項目,讓使用者能順利進行各項結構生物學與交互作用體相關的研究。